Estudios bioquimicos y geneticos de la interaccion planta-bacterias solubilizadoras de fosfato

Abstract

En el presente trabajo de tesis se realizaron estudios bioquímicos y genéticos en las bacterias endófitas nativas de maní Serratia sp. S119 y Pantoea sp. J49 con el objeto de comprender procesos involucrados en su capacidad de solubilización de fosfato y en su interacción con las plantas. Se analizó si el cofactor PQQ de estas bacterias participa en la capacidad solubilizadora de fosfato, en la modulación de la respuesta bacteriana antioxidante y en la respuesta de defensa de la planta frente a la inoculación con las mismas. El genoma completo de ambas bacterias fue también obtenido en esta tesis Para determinar si el cofactor PQQ está involucrado en la capacidad solubilizadora de fosfato de Serratia sp. S119 se realizó mutagénesis sitio dirigida del gen pqqE. A partir de estudios bioquímicos y genéticos de las transconjugantes obtenidas se seleccionó la cepa RSL. Esta cepa no produce PQQ y los niveles de ácido glucónico que sintetiza son significativamente menores a los de la cepa salvaje. Los ensayos realizados con esta cepa permitieron corroborar que, en Serratia sp. S119, el gen pqqE es indispensable para la síntesis de PQQ y que esta bacteria solubiliza fosfato a través de la vía de oxidación directa de la glucosa (GDH-PQQ) Los ensayos en microcosmo indicaron que PQQ no participa en la promoción del crecimiento de plantas de maní y maíz ya que la inoculación con la mutante no productora del cofactor promovió de igual manera que la cepa salvaje el crecimiento de las plantas. Se determinó la presencia de las dos cepas en el soporte y en el interior de los tejidos de tallos y raíces de maíz y maní, a excepción de la mutante que no fue aislada del interior de las raíces de esta última planta. Sin embargo, el número de bacterias mutantes aislado fue menor al de bacterias salvajes. Esto sugiere que existiría una relación entre la presencia del cofactor PQQ en Serratia sp. S119 y su capacidad de colonización endofítica Por otro lado, en la bacteria Pantoea sp. J49 se encontró que el cofactor PQQ no pareciera estar involucrado en su capacidad solubilizadora de fosfato, por lo que se propone que dicha habilidad podría vincularse con otros mecanismos como la producción de otros ácidos orgánicos, inorgánicos o a la eliminación de protones Se determinó también que el operón pqq de Serratia sp. S119 está compuesto por los genes pqqA,B,C,D,E,F, ubicados en ese orden. El análisis de la secuencia nucleotídica del gen pqqE completo de Serratia sp. S119 reveló que presenta dominios característicos muy conservados dentro del género Serratia. Se determinó que el gen pqqE de Serratia sp. S119 se expresa en niveles constantes cuando crece en presencia de P disponible mientras que en condiciones limitantes de P dicha expresión se incrementa con el tiempo de cultivo. Resultados similares fueron obtenidos del análisis de la expresión de la región promotora del operón pqq de S119. Tanto la expresión de pqqE como de la región promotora del operón pqq son modificados cuando la bacteria se enfrenta a exudados radicales de plantas de maní crecidas en condiciones deficientes de P y con P soluble Para evaluar el rol del cofactor PQQ en la modulación de la respuesta de defensa de la planta de maní durante la interacción con bacterias solubilizadoras de fosfato, se cuantificó los niveles de H20 2 en raíces de plantas inoculadas con Serratia sp. S119 y la mutante isogénica RSL. Los resultados obtenidos sugieren que la planta responde a la inoculación con una bacteria solubilizadora de fosfato en etapas tempranas de la interacción produciendo un estallido oxidativo. Considerando que en plantas inoculadas con la cepa salvaje la respuesta de defensa oxidativa fue más tardía y menos exacerbada es posible inferir que este cofactor podría modular dicha respuesta. Con respecto al rol de PQQ en la respuesta antioxidante bacteriana, los datos obtenidos en ensayos ex planta con la mutante RSL indican que el cofactor PQQ modula dicha respuesta, probablemente modificando la actividad de la enzima catalasa En su conjunto los resultados obtenidos en esta tesis, permiten proponer que PQQ sería esencial para la producción de ácido glucónico a través de la oxidación directa de la glucosa (GDH-PQQ) lo que le permitiría solubilizar fuentes minerales de P. Cuando Serratia sp. S119 crece en presencia de P insoluble se incrementa la expresión de los genes responsables de su síntesis posibilitando por lo tanto la solubilización de fosfato Por otro lado, en condiciones de estrés oxidativo PQQ sería requerido para incrementar la actividad de enzimas catalasas, probablemente induciendo la transcripción de los genes cat responsables de su síntesis y/o a través de modificaciones post- traduccionales. Además PQQ participaría en el establecimiento de una interacción benéfica exitosa entre la planta de maní y Serratia sp. S119 ya que modularía su respuesta de defensa frente a dicha bacteria.