Produccion y regulacion de bacteriocinas en Pseudomonas fluorescens SF39a

Abstract

Las bacteriocinas son compuestos antimicrobianos de naturaleza proteica, producidos por bacterias y, capaces de matar a otras bacterias relacionadas filogenéticamente a la cepa productora. Estos compuestos tienen numerosas propiedades que los hacen interesantes para su aplicación en la industria alimenticia, en medicina y en el área agronómica. El objetivo del presente trabajo es estudiar la producción y regulación de bacteriocinas en la rizobacteria promotora del crecimiento vegetal Pseudomonasfluorescens SF39a Mediante un análisis in silico, se identificaron genes para dos tipos de bacteriocinas en el draft del genoma de la cepa SF39a. En el contig 28, se identificó un gen (que denominamos pys) que codifica para una bacteriocina homóloga a las piocinas tipo S (compuestos solubles de bajo peso molecular). Además, un cluster, de aproximadamente 40 genes, similar a los operones que codifican para las piocinas tipo R y F (bacteriocinas de alto peso molecular similares a colas de fagos) fue identificado en el contig 17 En ensayos de inhibición en placa, la cepa SF39a fue capaz de inhibir a numerosas bacterias filogenéticamente relacionadas, incluyendo, fitopatógenos que causan importantes pérdidas en la producción fruti-hortícola. En todos los casos, se observaron halos de inhibición de gran diámetro alrededor de la colonia. Además, las bacteriocinas extraídas de sobrenadantes de cultivos mostraron sensibilidad a proteinasa K y temperatura. Todas estas propiedades son características de las piocinas tipo S. Por lo tanto, en esta tesis se construyó un mutante en el gen pys, el cual, presentó un fenotipo deficiente en la producción de bacteriocina, indicando que la cepa SF39a produce una piocina tipo S funcional. Esta es la primer piocina S caracterizada en P. fluorescens El estudio de la regulación de bacteriocinas producida por PGPRs es relevante debido a su potencial aplicación como agentes de control biológico o biofertilizantes. Por lo tanto, se realizó una mutagénesis al azar en la cepa SF39a con el objetivo de identificar posibles genes implicados en la regulación de bacteriocinas. Se obtuvieron 2 mutantes de P. fluorescens SF39a en genes regulatorios que presentaron un fenotipo alterado en la producción de bacteriocinas: los mutantes SF39a-451 y SF39a-375 El mutante SF39a-451 mostró una marcada disminución en la producción de bacteriocinas con respecto a la cepa salvaje. Este fenotipo fue causado por la inactivación del gen ptsP, el cual, codifica para la enzima EINtr del sistema fosfotransferasa específico para nitrógeno (PTSN"). Además, varios procesos que impactan en el desempeño de la bacteria en el medio ambiente, como movilidad, producción de sideróforos, formación de biofilm y producción de proteasas, se vieron afectados en dicho mutante. Finalmente, mediante un ensayo de colonización en plantas de trigo, se comprobó que el mutantes SF39-451 es menos competitivo e incapaz de colonizar la rizósfera de trigo con el mismo éxito que la cepa salvaje El mutante SF39a-375 presentó un aumento en la producción de bacteriocinas con respecto a la cepa salvaje. La secuenciación de la región interrumpida por el transposón reveló que el mismo se insertó en el gen cbrA. Este gen codifica para el sensor histidina quinasa del sistema de dos componentes CbrAB. En P. aeruginosa y P. putida, el sistema CbrAB participa en una vía regulatoria más compleja, el sistema CbrA/Crc: Cuando CbrAB se activa, aumentan los niveles del pequeño ARN CrcZ, el cual, antagoniza la actividad de la proteína Crc (represor traduccional). En este trabajo se construyeron mutantes por deleción en cada uno de los genes (cbrA, cbrB, crcZ y crc) que codifican para la cascada CbrA/Crc. Los mutantes cbrB- y crcZ, al igual que el mutante cbrA- (SF39a-375), mostraron un aumento en la producción de bacteriocina con respecto a la cepa salvaje; mientras que, el mutante crc- presentó una disminución en el halo de inhibición. Estos resultados indican que la vía CbrA/Crc controla la expresión de bacteriocinas en la cepa SF39a, probablemente, mediante una modulación indirecta. Además, los mutantes cbrA", cbrB-, crcZ y crc- fueron menos competitivos que la cepa salvaje SF39a en la rizósfera de trigo, sugiriendo, la importancia de este sistema en el establecimiento exitoso de la bacteria en el medio ambiente Los resultados obtenidos en este trabajo aportan información acerca de nuevos mecanismos regulatorios implicados en la producción de bacteriocinas.