Desarrollo de estrategias para generar fibroblastos fetales bovinos geneticamente modificados y embriones bovinos transgenicos mediante inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI)

Abstract

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias Es así que, el presente proyecto persiguió desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos Capítulo I: La estrategia propuesta, se basaba en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (1-Scel) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa) flanqueado por sitios para la endonucleasa. Se generaron varias líneas transgénicas de fibroblastos fetales bovinos mediante sub-cultivo de las colonias fluorescentes en placas individuales. Las células transgénicas fueron empleadas para generar embriones modificados genéticamente por transferencia nuclear de células somáticas (TNCS).Adicionalmente, estudiamos se generaron embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-Scel más la enzima 1-Scel al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivaron in vitro, inspeccionándolos a los días 4, 6 y 7 para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen 1 . Los embriones que alcanzaron el estado de blastocisto y expresaron el transgén fueron estudiados para determinar la presencia del transgén mediante el análisis de su ADN Capítulo II: Decidimos proponer un tratamiento de maduración ovocitaria bifásico mediante el uso de moduladores de AMPc. Este tratamiento consta de dos etapas, en la primera se intenta aumentar la concentración intracelular de este mensajero químico mediante el uso de Forscolina e IBMX, con el fin de evitar el reinicio prematuro de la meiosis. En la segunda etapa, se busca evitar la degradación del AMPc producido mediante el uso de Cilostainida, induciendo a su vez la maduración de los ovocitos mediante la utilización de FSHrh. Se logró estandarizar la maduración bifásica in vitro de ovocitos bovinos provenientes de ovarios de mataderos. Estos resultados sugieren que el uso de moduladores de AMPc durante el proceso de maduración genera ovocitos de mayor competencia ovocitaria, lo que se refleja en el aumento de la productividad y calidad de los embriones producidos. Este tratamiento se propone entonces como una alternativa a los protocolos de maduración estándares utilizados en PIV de embriones bovinos y otras especies de interés zootécnico Palabras clave: ganado bovino, embrión, 1-SceI, endonucleasa, transgénesis, ICSI, ovocito, maduración, AMPc, PIV.