Efectos terapeuticos de las bacteriocinas producidas por las cepas de Lactobacillus Fermentun y Lactobacillus Rjhmnosus sobre microorganismos causales de infecciones genitales

Abstract

En este trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana de dos cepas de lactobacilosdenominadas L. fermentum L23 y L. rhamnosus L60 aisladas del tracto genital femeninosobre microorganismos patógenos como Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus agalactiae Ambas especies de lactobacilos fueron identificadas por pruebas bioquímicas, sistema API50CH y por análisis molecular del ADNr 16S. Se demostró que estas cepas producen unagran variedad de metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana, entre ellos sedestaca la producción de bacteriocinas, las cuales han sido detectadas, caracterizadas ypurificadas. Otros metabolitos sintetizados por estas dos bacterias ácido lácticas son losácidos orgánicos y además el H202 producido por L. rhamnosus. En el presente trabajo detesis se realizaron los estudios in vitro de las actividades antimicrobianas de las cepas delactobacilos probióticas como así también, de las sustancias antimicrobianas sintetizadaspor cada lactobacilo sobre los microorganismos patógenos estudiados. Se demostró queestos metabolitos biológicamente activos presentes en los sobrenadantes de L. fermentumL23 y L. rhamnosus L60 sobre 31 cepas de N. gonorrhoeae produjeron una inhibición delcrecimiento del 100% de estas cepas. Todas las cepas de N. gonorrhoeae fueron sensiblesa cada una de las bacteriocinas producidas por las cepas de lactobacilos L23 y L60 conhalos promedios de inhibición del crecimiento de 15,8 mm y 15 mm respectivamente. Entreel 80-87% de la inhibición de los gonococos correspondió a la acción de las bacteriocinas deambos lactobacilos. En los ensayos de interacción entre las bacteriocinas se observó que el100% de las cepas de N. gonorrhoeae ensayadas presentaron una actividad sinérgicamediante el ensayo de pozos próximos. Cuando se determinó la CIM de las bacteriocinasproducidas por ambas cepas lácticas, se obtuvieron resultados relevantes ya que aundiluidas estas sustancias presentaron una muy buena actividad inhibitoria sobre losgonococos ensayados. En el estudio de la actividad antimicrobiana de los lactobacilos sobrelas 57 cepas de S. agalactiae, mediante la técnica de estrías cruzadas, se halló que el 100%de las mismas fueron susceptibles a las sustancias inhibitorias producidas y secretadas porestos lactobacilos. Sin embargo, cuando se evaluó la actividad antimicrobiana de lasbacteriocinas L23 y L60 sobre las cepas de estreptococos, se observó que el 91% (52cepas) de las mismas fueron inhibidas por ambas bacteriocinas, sin mostrar diferenciasestadísticas significativas entre estos metabolitos. Al evaluar la CIM de la bacteriocina L23 yL60 mediante la técnica de microdilución en placa se observó que ambas sustancias fueronactivas a concentraciones bajas con valores de CIM entre 80 y 160 UA/ml, respectivamente En el estudio cualitativo de las interacciones de las bacteriocinas L23 y L60 se observóinteracción sinérgica en el 100% de las cepas sensibles de S. agalactiae, no se encontraronotras interacciones como antagonismo e indiferencia entre las bacteriocinas. Este últimoresultado, fue luego corroborado mediante dos técnicas, de difusión en pozo y del tablero deajedrez. En el primer caso los resultados mostraron un 100% de sinergismo de potenciaciónsobre S. agalactiae (p<0,05). En la técnica del tablero de ajedrez, se confirmó el efectoantimicrobiano sinérgico producido por la combinación de las bacteriocinas L23 y L60 con unvalor de concentración inhibitoria fraccionaria (CIF) de 0,13 - 0,84, indicando una interacciónsinérgica entre ambas sustancias. En este estudio mediante estas técnicas no seobservaron interacciones de sinergismo aditivo, antagonismo o indiferencia entre losmetabolitos de ambas cepas de lactobacilos. Las bacteriocinas L23 y L60 no presentaronactividad hemolítica sobre las especies de eritrocitos estudiadas. Con respecto a losensayos in vivo no se observaron en la microbiota vaginal de los ratones BALB/c presenciade lactobacilos ni de SGB. En este trabajo de tesis se logró la colonización vaginal deS. agalactiae, con valores de 10g10 entre 5 a (t1) y 2,08 a (t8) de bacterias viables/mi desecreción vaginal en el período en que se realizó el ensayo. En las experiencias decolonización vaginal de las cepas de L. fermentum L23 y L. rhamnosus L60, se demostróque ambos fueron capaces de permanecer y colonizar por 8 días la vagina de los ratones,con valores de 10g10 superiores a 2 (p<0,01), durante el tiempo en que se realizó laexperiencia. En el estudio del efecto preventivo de L. fermentum L23, L. rhamnosus L60, yde una mezcla de L23+L60 sobre S agalactiae en ratones hembras BALB/c, una única dosisde estos lactobacilos fue necesaria para eliminar a SGB del tracto vaginal del modelo animal(p<0,05), (96 h, 120 h, 72 h, respectivamente). En las experiencias de efecto curativo decada lactobacilo y de la mezcla de L23+L60 sobre SGB en ratones BALB/c, se observó queRESUMEN Tesis Doctoral Francisco O. Ruízla mezcla de lactobacilos resultó más efectiva en comparación con cada cepa de lactobacilo,permaneciendo con un valor logarítmico de 3,10 al final de la experiencia (t8). De estamanera, se demostró el efecto potencial antimicrobiano que poseen las cepas delactobacilos L23 y L60, aún siendo inoculadas posteriormente, para desplazar elestreptococo del nicho vaginal. Al estudiar la concentración adecuada de L. fermentum L23y L. rhamnosus L60 necesaria para eliminar a S. agalactiae de la vagina de ratones BALB/cse probaron 4 concentraciones diferentes (109, 101, 106 y 104 UFC/ml) de cada una de lasbacterias ácido lácticas en distintos grupos de animales. El efecto curativo realizado concada lactobacilo empleando concentraciones altas (109), medias (108) y moderadamentebajas (106), demostró la eliminación del SGB de la vagina de los ratones, en 48 h para lasconcentraciones más altas y en 120 h para las moderadamente bajas. A la concentración104 UFC/ml, las cepas de lactobacilos no eliminaron a S. agalactiae. Este trabajo de tesisdemostró la efectividad de estas dos cepas de lactobacilos probióticas probadas en losensayos in vitro, correlacionado con los ensayos in vivo, aportando resultados relevantes yaque con una única inoculación se logró eliminar al microorganismo patógeno del modeloanimal, mostrando además, un sinergismo de potenciación cuando se administraron demanera conjunta, hallazgos no descriptos en la bibliografía entre dos cepas productoras debacteriocinas.