Purificacion de peroxidasas vegetales para la produccion de reactivos de enzimoinmunoanalisis, EIA, y de diagnostico clinico

Abstract

Las peroxidasas son enzimas ampliamente distribuídas en plantas y microorganismos, de gran utilidad como reactivos de diagnóstico en bioquímica clínica o en técnicas de enzimoinmunoanálisis (ETA), como así también en la industria química, alimenticia, inmunoquímica, biología celular, histoquímica, etc. La enzima comercialmente disponible, a un costo relativamente alto, se obtiene a partir de las raíces de rábano picante (Armoracia rusticana), especie que no se cultiva en Argentina, por esta razón intentamos la búsqueda de fuentes alternativas de peroxidasas, como las raíces de nabo (Brassica napus) o eventualmente los cultivos in vitro de esta especie vegetal (como las suspensiones celulares y los cultivos de raíces en cabellera), con la intención de producir estas enzimas en escala comercial. A partir de los extractos de raíces de nabo se purificaron las isoenzimas aniónicas Al y A2 de pI 3,7 y 3,6 respectivamente. Los cultivos de callos y suspensiones celulares, si bien produjeron peroxidasas, presentaron un bajo índice de crecimiento por lo cual se los descartó como potenciales productores de enzimas en gran escala. En cambio los cultivos de raíces en cabellera presentaron un crecimiento óptimo y produjeron peroxidasas tanto en la masa tisular como en el medio de cultivo (enzima secretada). La secreción fue estimulada posteriormente por el agregado de NaCl y CaCl2 en diferentes concentraciones. Se seleccionaron para su purificación las isoenzimas HR1 (pI 6,3) (de las raíces propiamente dichas) y HR2 (pI 9,6) (del medio de cultivo). Con las 4 isoenzimas de peroxidasa purificadas (Al, A2, HR1 y HR2) se realizaron estudios cinéticos, de estabilidad térmica y en el tiempo, se determinó la inactivación frente a H20 2, las constantes catalíticas que caracterizan la peroxidación y el PM, entre otras propiedades. Posteriormente se determinó si dichas isoenzimas podían ser aplicadas en bioquímica clínica y en ETA, para lo cual se las utilizó en el dosaje de ácido úrico y se conjugó a A2 y 1-IR1 con anticuerpos anti IgG humana con resultados satisfactorios. En conclusión, las enzimas caracterizadas presentaron propiedades que las hicieron atractivas para ser empleadas en aplicaciones biotecnológicas lo cual quedó demostrado al menos en lo que se refiere a producción de reactivos de diagnóstico clínico y de EIA.