Bioenergetica de la incorporacion de fosforo y acumulacion de polifosfatos por colina en Pseudomonas aeruginosa

Abstract

En esta tesis se estudió la relación entre el metabolismo de colina y de fósforo en Pseudomonas aeruginosa. En principio se determinó la composición de P. aeruginosa crecida con colina comparada siempre con las crecidas con ácido succínico y cloruro de amonio, estas dos ultimas son las fuentes preferenciales de carbono y de nitrógeno para P aeruginosa, Se encontró que en las bacterias crecidas en presencia de colina existe una disminución del 65% del contenido del fósforo total y23 % del ATP. Esto fue acompañado por un incremento del 50 % en los glúcidos totales, 48 % en la cantidad de LPS y del 42% en los polifosfatos. El contenido de 30 ?moles de PW fonol de KDO en el LPS y el de 0.6 ?mol de Pi/ilmol de KDO en el Lip A fueron los mismo para la bacteria en ambas condiciones de cultivo. Los ac. grasos contenidos en el Lip A fueron ac. palmítico, esteárico y un hidroxiácido de 12 carbonos. Estos tampoco presentaron variaciones en su cantidad o composición. Sin embargo, se observó también un incremento del 70 % en el contenido de glúcidos en el LPS Los cambios en la composición bacteriana fueron corroborados por el estudio morfológico comparativo de las bacterias. En estos se observó la presencia de polifosfatos, formación de vesículas y disminución del tamaño de la bacteria que explicaron el aumento del contenido de LPS y lo relacionaron con el mecanismo de secreción de PLC, esto relaciona la excreción de una exotoxina (PLC) con el incremento en la biosíntesis de una endotoxina (LPS), ambas muy importantes para el mecanismo de infección de las bacterias. Se estudió, también, el rendimiento energético de la combustión de colina y succínico usando el programa semiempírico AMPAC , los valores de energía libre para el ac. succínico de -1556 Kcal/mol, valor calculado y -871 Kcal/mol para colina, producen 119 ATP/ mol de colina y 222 ATP/mol ac. succínico consumidos. Acorde a estas estimaciones teóricas se cuantificó el contenido de ATP en la bacteria crecida con fuentes de carbono de rendimiento superior e inferior a la de colina y ac. succínico y se comprobó que existe una relación lineal entre el calor de combustión de la fuente de carbono y el contenido intracelular de ATP. Considerando que el balance energético de las variaciones observadas en la composición de la bacteria crecida con colina, mostró que existe un ahorro de energía de aproximadamente 500 ?moles de ATP/ g de bacteria y que se incrementó del crecimiento bacteriano con la concentración del 0 2, en presencia de colina, se propuso que con el cambio de la composición la bacteria ahorra ATP que seria acumulado como PP. Por otro lado, el bajo rendimiento energético de colina le impide a la bacteria incorporar mas Pi al ADP, a pesar de la alta concentración del mismo en el medio de cultivo El estudio termodinámico de la cinética del crecimiento bacteriano explica los cambios en la composición y morfología de P. aeruginosa producidos por el catabolísmo de colina, una fuente de carbono de bajo rendimiento energético que la bacteria encuentra in vivo cuando infecta al organismo huésped. En este sentido, esta tesis realiza una contribución a un área de la bioquímica que no ha sido muy explorada desde 1950, época en que Monod y otros realizaron grandes aportes en este área El estudio del metabolismo de los polifosfatos desde el punto de vista bioenergético, y de los metabolitos involucrados en la biosíntesis y degradación de estos, se continuó con el estudio de la actividad polifosfato fosfatasa, una de las enzimas involucrada en la acumulación de los polifosfatos, cuando P. aeruginosa crece en presencia de colina. Se puso a punto la cuantificación de la actividad polifosfato fosfatasa en extracto periplásmico y se observó que esta enzima tiene dos Km diferentes para todas las longitudes de polifosfatos probadas, presenta mayor afinidad por los polifosfatos de mayor longitud, 0,2 y 2 p.M para PP79. La afinidad y eficiencia catalítica de la enzima disminuye con la disminución del largo de cadena. Esta enzima hidroliza prioritariamente los polifosfatos de cadena más larga y luego continua con los polifosfatos mas cortos, es activada por iones divalente de relación carga/radio de 0,3, tal como Mg , Mn++ y Zn++ y tiene dos optimos de pH a 5,8 y Los estudios preliminares para la purificación de la polifosfato fosfatasa del extracto periplásmico mostraron la presencia de tres fracciones proteicas de peso molecular 200.000, 70.000 y 24.000 con actividad polifosfato fosfatasa. Tanto en presencia de colina o succínico y amonio P. aeruginosa produce niveles similares de actividad polifosfato fosfatasa lo que indicaría que la acumulación de polifosfatos se debería a una mayor actividad polifosfato quinasa, esta enzima se ha descripto que responde al estrés oxidativo y osmótico y es inducida por bajo fosfato pero no presenta corregulación a nivel de los promotores con la polifosfato fosfatasa. Posteriores estudios sobre el efecto de colina sobre la actividad polifosfato quinasa pueden brindar datos mas directos sobre el aspecto enzimológico de la acumulación de polifosfatos