Sintesis y caracterizacion de nanoparticulas de polimeros conjugados con aplicaciones en fototerapias

Abstract

La resistencia a los antibióticos constituye una de las principales amenazas sanitarias a nivel mundial, impulsada por la creciente y continua aparición de bacterias multirresistentes como consecuencia del abuso, el uso inadecuado y la implementación de protocolos terapéuticos ineficientes en la administración de antibióticos. De manera paralela, en el ámbito del tratamiento del cáncer, la resistencia a la quimioterapia, la escasa selectividad de numerosos fármacos antineoplásicos y su elevada toxicidad sistémica limitan significativamente la eficacia clínica, favorecen la recurrencia tumoral y deterioran la calidad de vida de los pacientes. En conjunto, ambas problemáticas evidencian la necesidad urgente de desarrollar estrategias terapéuticas innovadoras que superen las limitaciones de las terapias convencionales, eviten los mecanismos clásicos de resistencia y reduzcan los efectos adversos asociados. En este contexto se encuentra la terapia fotodinámica microbiana y la terapia fotodinámica aplicada al tratamiento del cáncer como alternativas terapéuticas prometedoras. Estas estrategias se basan en el empleo de fotosensibilizadores que, tras su activación por luz y en presencia de oxígeno molecular, inducen la producción de especies reactivas de oxígeno capaces de provocar la muerte selectiva de bacterias y células tumorales. La elevada selectividad del tratamiento, la baja toxicidad sistémica y la escasa probabilidad de inducción de resistencia colocan a la terapia fotodinámica como una opción alternativa frente a las limitaciones propias de los tratamientos tradicionales. En esta tesis se proponen distintas estrategias para el desarrollo de nanopartículas de polímeros conjugados, las cuales están destinadas a ser utilizadas como fotosensibilizadores en las fototerapias con objetivo mejorar la eficiencia de la terapia fotodinámica tanto en el tratamiento del cáncer (particularmente sobre células de glioblastoma), como en la inactivación fotodinámica microbiana de cultivos planctónicos y biofilms maduros de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Las nanopartículas de polímero conjugado se sintetizaron mediante un método de nanoprecipitación controlada utilizando el polímero poli[(9,9-di-n-octilfluorenil-2,7-diil)- alt-(benzo[2,1,3]-tiadiazol-4,8-diil)]. Con el fin de mejorar la estabilidad coloidal y funcionalizar la superficie de las nanopartículas, se emplearon distintos polímeros Tesis Doctoral En Ciencias Químicas - Arianna Lourdes Sosa Lochedino 2 estabilizantes, incluyendo poli(estireno-co-anhídrido maleico), Tetronic® T-1107 (70 % p/p de poli(óxido de etileno)) y Tetronic® T-1107 modificado con D-(+)-glucono-1,5-lactona. Asimismo, para incrementar la eficiencia en la generación de especies reactivas de oxígeno propia de los polímeros conjugados, las nanopartículas se doparon volumétricamente con octaetilporfirina de platino(II) o superficialmente con meso-tetra(4-carboxifenil)porfirina de Pt(II). Adicionalmente, la carga superficial de las nanopartículas se modificó mediante la adsorción de un segundo polímero conjugado, poli[(9,9-bis(3´-(N,N,N-dimetil)-N- etilamonio-propil)-2,7-fluoreno-alt-2,7-(9,9-dioctilfluoreno))] dibromuro, obteniéndose así sistemas del tipo core/shell. Las distintas estrategias de diseño de las nanopartículas se centraron, por un lado, en la reducción de su diámetro con el fin de favorecer la penetración hacia el interior de los biofilms y, por otro, en la modificación de la carga superficial para obtener nanopartículas catiónicas capaces de interactuar de manera más eficiente con las envolturas bacterianas y con los componentes aniónicos de la matriz del biofilm. Paralelamente, se evaluó el uso de diferentes polímeros estabilizantes para funcionalizar la superficie de las nanopartículas y promover su interacción e internalización en células tumorales. Por último, se doparon superficialmente las nanopartículas con el objetivo de incrementar la eficiencia en la producción de especies reactivas de oxígeno con respecto a las nanopartículas dopadas volumétricamente. Se lograron obtener nanopartículas de polímero conjugado de diámetro reducido mediante la variación de distintos parámetros de síntesis, tales como la concentración del polímero estabilizante y el empleo de diferentes medios acuosos, incluyendo soluciones a distintas temperaturas, soluciones buffer a diferentes valores de pH y soluciones de surfactantes. Mediante estas estrategias fue posible sintetizar nanopartículas con diámetros de hasta 5 nm. La incorporación de un segundo polímero conjugado permitió la obtención de nanopartículas del tipo core/shell, logrando invertir la carga superficial y produciendo un cambio en el potencial zeta de ?27 a +16 mV. Asimismo, se desarrollaron nanopartículas estabilizadas con distintos polímeros para optimizar su interacción con células tumorales. Finalmente se obtuvieron nanopartículas dopadas superficialmente con distintas concentraciones de porfirina. La caracterización fisicoquímica de los sistemas obtenidos se llevó a cabo mediante espectrofotometría UV-visible y de fluorescencia, dispersión dinámica de la luz, microscopía electrónica de transmisión y mediciones de potencial zeta. Finalmente, se estudió la interacción de las nanopartículas core/shell con bacterias en estado planctónico mediante las técnicas de citometría de flujo, potencial zeta y microscopía electrónica de transmisión. Posteriormente se realizaron ensayos de inactivación fotodinámica microbiana tanto en cultivos planctónicos, mediante recuento de colonias y curvas de crecimiento post irradiación, como en biofilms, mediante las técnicas de cristal violeta, reducción del azul de tiazolil bromuro de tetrazolio, ensayo de la resazurina, cuantificación de proteínas libres en el sobrenadante, tinción de la matriz de exopolisacáridos y microscopía electrónica de transmisión. Los resultados evidenciaron una mejora significativa en la eficiencia de la inactivación fotodinámica microbiana al emplear nanopartículas de diámetro reducido y nanopartículas core/shell, en comparación con nanopartículas de polímero conjugado desarrolladas previamente por el grupo de trabajo. No se observó una mejora en la vectorización hacia células tumorales al utilizar nanopartículas funcionalizadas con Tetronic® T-1107 ni con Tetronic® T-1107 modificado con D-(+)- glucono-1,5-lactona mediante la técnica de citometría de flujo. Asimismo, el dopado superficial con porfirina no condujo a una mejora en la transferencia de energía responsable de la generación de oxígeno singlete en comparación con el dopado volumétrico. En conjunto, estos resultados confirman las hipótesis planteadas y demuestran que el diseño racional de nanopartículas de polímero conjugado permite optimizar su desempeño en terapias fotodinámicas antibacterianas.