Desarrollo de microscopio confocal de fluorescencia : elaboracion de software para adquisicion y analisis de imagenes

Abstract

La microscop ??a de fluorescencia confocal se ha convertido en una herramienta fundamental para estudiar muestras biol ?ogicas, como as ?? tambi ?en para la aplicaci ?on de t ?ecnicas de micros- cop ??a y espectroscop ??a de mol ?ecula individual (SMFS, por sus siglas en ingl ?es) al estudio de materiales nanoestructurados. Su capacidad de seccionado ?optico por medio de la remoci ?on de la fluorescencia de regiones de la muestra fuera de foco, la posibilidad de adquisici ?on de im ?agenes tridimensionales, y su mejora en la resoluci ?on, son ventajas de esta t ?ecnica sobre otras microscop ??as de fluorescencia, como son la de campo amplio y de reflexi ?on total interna (TIRFM, por sus siglas en ingl ?es). Adem ?as, la microscop ??a confocal permite la aplicaci ?on de otras t ?ecnicas avanzadas como FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) y diversas t ?ecnicas de superresoluci ?on. El presente trabajo consisti ?o en la implementaci ?on de la microscop ??a de fluorescencia confocal mediante la modificaci ?on del camino ?optico de excitaci ?on y de detecci ?on de un microscopio de fluorescencia personalizado inicialmente operando en modo de campo amplio. De esta manera, el microscopio tiene ahora la capacidad de operar de forma alternada tanto en modo campo amplio, como en modo confocal. Tambi ?en se ha construido un sistema autofoco, basado en la aplicaci ?on de un algoritmo PID para controlar (mediante una plataforma nanoposicionadora) la posici ?on de un l ?aser infrarrojo que sufre reflexi ?on total interna en el portamuestras y luego incide sobre el chip de una c ?amara web. Este sistema puede ser utilizado mientras se adquieren im ?agenes tanto de campo amplio como confocales, y su software de control ha sido desarrollado en Python. Finalmente se ha desarrollado, tambi ?en en Python, el software que controla y coordina los componentes del microscopio para poder lograr la adquisici ?on de im ?agenes confocales y transcientes de fluorescencia, a la vez que se corrige activamente la deriva de foco mediante el sistema de autofoco mencionado anteriormente.