Produccion de embriones bovinos transgenicos mediante transferencia nuclear a partir de fibroblaastos modificados geneticamente con un sistema basado en un transposon (Sleeping Beauty)

Abstract

La transgénesis activa mediada por transposones es una herramienta valiosa para lainvestigación básica y aplicada en roedores de laboratorio y ganado. Los principalesobjetivos de la producción de ganado transgénico son: el estudio de cuestiones biológicasrelacionadas con el desarrollo, genética, reproducción y enfermedad, así como laproducción de proteínas recombinantes o la evaluación de xenotrasplantes para pacienteshumanos. En los últimos años, se han realizado mejoras significativas para introducir yaplicar técnicas activas de transgénesis e ingeniería genética. Estos nuevos enfoquesmejoran drásticamente la facilidad y la velocidad con la que las especies de ganadopueden modificarse genéticamente y permiten realizar modificaciones genéticas precisas En este trabajo ampliamos estudios previos del laboratorio al examinar la capacidad deun transposón Sleeping Beauty (SB) para administrar transgenes al genoma defibroblastos fetales bovinos (FFB), y la capacidad de estas células para el desarrollo deembriones in vitro en transferencia nuclear de células somáticas (TNCS) Independientemente de la relación utilizada para transfectar los cultivos de BFF, siempreque se incluyó una transposasa SB funcional (codificada en un vector), el número decolonias fluorescentes y resistentes a G418 fue notablemente mayor en comparación conel control respectivo sin transposasa (hasta 88 veces más). Curiosamente, todas lascolonias resistentes a G418 expresaron Venus. La caracterización molecular de lasinserciones genómicas en seis líneas celulares monoclonales se realizó mediante PCR ysplinkerette-PCR. El análisis de PCR confirmó la presencia del transgén Venus en todaslas líneas celulares. La Splinkerette-PCR confirmó 15 inserciones genómicas catalizadaspor transposasa del transgén. Células individuales de un cultivo de fibroblastostransgénicos (SB) policlonales se usaron como donantes de núcleos para producirembriones TNCS. El 33% de los embriones reconstruidos alcanzó el estadio deblastocisto, y aproximadamente la mitad de los mismos expresaron Venus En conclusión, la SB transposasa es capaz de transponer activamente copias monoméricasde transgenes en el genoma de células bovinas que pueden reprogramarse tras latransferencia nuclear para generar embriones morfológicamente normales que expresanel transgén de interés.