Analisis genomico y funcional del efecto de la luz sobre el crecimiento, desarrollo y capacidad PGPR de Azospirillum brasilense Az39, la cepa mas utilizada en la formulacion de inoculantes para no-leguminosas en la Republica Argentina

Abstract

La luz es un factor ambiental necesario para el crecimiento de muchos organismos, principalmente aquellos fotosintéticos. Luego del descubrimiento de proteínas receptoras de luz en bacterias no fotosintéticas, surgió la incógnita acerca de la función que desempeñan estas proteínas en el metabolismo y estilo de vida de éste grupo de bacterias. Nuestra hipótesis de trabajo se basó en que la luz modifica el crecimiento y desarrollo de Azospirillum brasilense Az39, una de las cepas más utilizadas para la formulación de inoculantes en Argentina. Para validar esta hipótesis, se propuso, realizar un análisis genotípico y funcional del efecto de la luz en ésta bacteria. Inicialmente, se analizó el genoma de Az39 para la búsqueda de secuencias relacionadas con la respuesta bacteriana a la luz. En una segunda etapa de trabajo y en condiciones de cultivo in vitro la bacteria se cultivó en medio sólido, semi-solido y líquido y expuesta a luz blanca 75W (LB), azul PAR38 (LA), roja PAR38 (LR) o mantenida en condiciones de oscuridad (O); para el caso del medio sólido, a temperaturas variables (28-36°C), diferentes distancias desde la fuente lumínica (10,18,24 y 28 cm) o intensidades, tiempos de exposición (2,4,8,12 y 24 h), medios de cultivo complejo (LB) y mínimo (MMAB).En el caso del medio semi-sólido se evaluó la movilidad (swimming) y en el caso del medio líquido la producción de biomasa (DO595 nm), el número de células (ufc.ml-1 ), la producción de ácido indol-3-acético (AIA), el porcentaje de agregación celular (%PA), la formación de biolfilms (DO560 nm) y la síntesis de exopolisacáridos (EPS). De manera complementaria, se realizó un análisis transcriptómico, mediante CLC de la bacteria expuesta a las diferentes condiciones de luz o mantenida en oscuridad y por último se correlacionó las respuestas de la bacteria a la exposición a diferentes luces a nivel del comportamiento de plántulas de Arabidopsis thaliana inoculadas. Nuestros resultados indican que Az39 contiene en su genoma 2 secuencias para la síntesis de proteínas del tipo fitocromo y una bacteriofitocromo Hemo-oxigenasa. En cultivo sólido, la exposición a LB y LA fue letal para el crecimiento de Az39, no así a la LR (similar al control); en medio nutricionalmente complejo, la bacteria fue menos tolerante a LB y LA mientras que a 28°C no creció en éste medio, ni tampoco en medio mínimo. A una distancia de la fuente de 10 y 18 cm, la bacteria no creció y 24 h de exposición a LB resultaron letales para la bacteria. En medio líquido, el crecimiento no resultó letal como en el medio sólido y la producción de AIA fue superior en LB en medio complejo. El %PA y la formación de biofilms, fue superior en LA, aunque aquí se observó la menor concentración de EPS. A nivel transcriptómico, la mayoría de genes que se sobreexpresaron por exposición a LB, estaban involucrados con procesos de división celular, estrés por calor o frío, quórum sensing y quenching, biosíntesis flagelar, etc.. La bacetriofitocromo hemooxigenasa, se indujo y el gen ipdc se reprimió, ambos en presencia de las 3 luces. Por último, a nivel in planta, se comprobó que concentraciones similares a 1.108 ufc.ml-1 de Az39 o 10 µg.ml-1 de AIA,inducen un acortamiento de la raíz principal e incremento del número de raíces laterales en A.thaliana. Por otro lado, concentraciones cercanas a 20 µg.ml-1 disminuyen el último parámetro. El crecimiento y desarrollo de Az39 es afectado por LB y particularmente por LA y dicho comportamiento depende de las condiciones de cultivo a las que la bacteria es expuesta