Tecnologia de Ig Y: Sistema inmune asociado a mucosas (malt)y a intestino (galt) en gallinas inmunizadas contra Escherichia coli K88

Abstract

En la gallina, los fragmentos bacterianos, administrados via intramuscular (IM), son reconocidos como extraños y entran en contacto con el sistema inmune mucosal (SIM), específicamente con la porción que se relaciona con el aparato digestivo (GALT). Aquí, los linfocitos aviares intestinales, inducen una respuesta específica al patógeno, a través de la secreción de la IgY, que es depositada en el huevo para otorgarle inmunidad pasiva al futuro polluelo. Una vez puesto el huevo, la IgY específica es fácilmente extraíble por distintos métodos y actúa como inmunoprofiláctico o inmunoterapéutico, en distintas enfermedades entéricas, como diarreas de lechones causados por Escherichia coli K88 (E coli K88). La hipótesis que se plantea en esta tesis es: la inmunización de gallinas en producción con lisado de E. coli K88, via IM, induce la activación de centros germinales en el GALT, generando una respuesta inmune, mediada por linfocitos B y T. El objetivo fue estudiar la respuesta inmune humoral asociada al GALT en gallinas, determinando la respuesta de los centros germinales luego de inmunizar las aves con usado de Escherichia coli K88. Se utilizaron 44 gallinas de color, Shaver, que fueron divididas en dos grupos: K88 (n=25) y Controles (n=19). A las 22 semanas de vida, las gallinas fueron inmunizadas con: Grupo K88: una bacterina de E. coli K88, (1x109 UFC/ml de bacteria, inactivadas con forrnol) y Grupo Control: adjuvante (hidróxido de aluminio), respectivamente, 0,5 ml en cada músculo pectoral. Se realizaron 4 inmunizaciones cada 2 semanas. Después de cada inmunización, se tomaron las muestras de sangre que fueron usadas para determinar la concentración de Ig Y total y específica e Ig A total (ELISA). Se recolectaron los huevos durante 8 semanas y se purificó la IgY para determinar su concentración total y específica (ELISA). A las 31 semanas se sacrificaron las aves, por dislocación cervical, previo toma de muestras de sangre para cuantificar los linfocitos B (citometría de flujo). Se recolectaron muestras de bazo y tonsilas esofágicas, pilóricas, cecales y muestras de intestino, las que fueron procesadas y teñidas por la técnica convencional y la inmunofluorescente. Se midió la histomorfometría de las vellosidades intestinales y el área de los centros germinales en los órganos del GALT y el bazo, mediante los programas Axio Vision Release e Image J. También se cuantificaron los niveles de IgA secretora en la mucosa intestinal (ELISA). Una porción del bazo fue usado para medir los linfocitos B (citometría de flujo). Los datos fueron analizados mediante ANOVA y posterior test de Tuckey, usando el programa Infostat. p<0,05 fue considerado significativo. Resultados: las gallinas del grupo K88 presentaron mayor número de linfocitos B periféricos y en el bazo XV (p<0,05) que las aves controles. Además, el grupo K88 tuvo mayor concentración de IgA sérica (r)0,05), mayor concentración de Ig Y total sérica y en yema (p<0,001), mayor concentración de IgA en mucosa (p<0,001) e IgY específica sérica y en yema (p<0,001) También, el grupo inmunizado con la bacterina presentó centros germinales más activos, con abundantes linfocitos B en las Tonsilas esofágicas, Placas de Peyer (p, 0,001) y tonsilas pilóricas y cecales (p<0,05) y en el bazo (p-0,001); evidenciándose marcación fluorescente también en los linfocitos B intraepiteliales del duodeno y en la lámina propia intestinal. En la histomorfometría, el grupo K88 presentó vellosidades intestinales más altas (p< 0,05) que el grupo control. Tambien se registró aumento en el número de células epiteliales, entremezcladas con las células plasmáticas en el grupo inmunizado con las bacterinas y un mayor número de células caliciformes que el grupo Control, en las vellosidades. La caracterización de la muestra de IgY proveniente de yema, determinada por el western blot estableció que esa proteína era IgY, y bajo condiciones reductoras, pudo ser separada en las dos fracciones que la componen. Los niveles de IgY que presentaba esa muestra, determinados por ELISA, fueron aproximadamente 8 mg/mi y la pureza obtenida fue del 43 %. Conclusión: La inmunización de gallinas con usado de Escherichia coli K88, via IM, activó por un lado, la protección mucosal, produciendo niveles altos de la IgA y por otro lado, la sistémica, produciendo niveles altos de IgY específica. La protección mucosal fue realizada a través de la activación de los linfocitos B en las Placas de Peyer y tonsilas esofágicas, principalmente. La respuesta inmune a la bacterina, en las vellosidades intestinales, luego de la interacción entre las células absortivas, las células inmunes y la microbiota, aumentó la protección física mediante el aumento en las células globosas y el mucus generado por éstas. La activación sistémica produjo un aumento en los niveles de IgY séricos, que luego de una semana fue depositada en la yema. Además, la proteína purificada a partir de la yema de huevos de las gallinas del grupo K88 era, efectivamente, IgY anti Escherichia coli K88, en buena concentración y alta pureza PALABRAS CLAVE: GALT — Escherichia coli K88 — GALLINAS — LINFOCITOS B - IgA — IgY — CITOMETRIA DE FLUJO — ELISA — HISTOMORFOMETRIA — ESTUDIO INMUNOFLUORESCENTE.