Utilizacion de nano-particulas magneticas para separar espermatozoides X de Y en semen equino

Abstract

La preselección de sexo antes de la concepción ha sido uno de los objetivos persegui- dos por científicos y criadores. En la industria de la leche y carne bovina existen razones objetivas y productivas para calcular el beneficio económico de desear un sexo ó el otro, sin embargo, en equinos el deseo de un sexo u otro, es más subjetivo y sujeto a otras variables La única forma reproducible y eficiente hasta hoy de separar espermatozoides que con- tienen el cromosoma X de los que contienen el cromosoma Y basado en el contenido de Ácido desoxiribonucleico (ADN) desde una muestra de semen es por medio del uso de la citometría de alto flujo desarrollada por Johnson en 1986. (Samper et. al, 2012) Sin embargo, sólo ha sido utilizada a nivel comercial y a gran escala en bovinos. El número de espermatozoides que pueden ser eficazmente seleccionados por hora en el citómetro de flujo ha sido una limitante para su aplicación masiva especialmente en especies que requieren de un alto número de espermatozoides para inseminar una hembra cómo es el equino (Panarace et. al, 2014). Además se deben considerar las susceptibilidades de estos gametos a los variados procesos que ocurren durante el se- xado por citometría de flujo (Garner, 2006) Por otro lado la aplicación en condiciones de campo de semen congelado y sexado re- quiere de mayor investigación para producir muestras de semen de mejor calidad que las que existen en el presente para hacerlo comercialmente sustentable. (Clulow et. al 2009) El presente estudio tuvo como objetivo principal el ensayar una nueva técnica de sepa- ración de espermatozoides que contienen uno u otro cromosoma sexual, considerando tres pilares fundamentales: 1) probar una técnica más rápida que la citometría de flujo actual, 2) obtener dosis de semen de mayor número de espermatozoides disponibles y 3) que la viabilidad del eyaculado original previo al proceso no sufriera detrimento al nivel que las técnicas actuales producen Se utilizaron 5 padrillos de distintas razas y entre 7 y 12 años de edad con fertilidad comprobada. Previo al estudio todos fueron colectados una vez al día por 7 días para realizar una depleción de sus reservas extra-gonadales y ponerlos en DSO (daily sperm output) o eyaculación diaria de espermatozoides estabilizada. Posteriormente durante el estudio los padrillos fueron colectados 2 veces por semana hasta completar 6 eyacula- dos totales por padrillo. Cada eyaculado fue separado en dos fracciones: grupo control (sin exposición a nano-partículas) y grupo experimental (procesado con nano-partículas para obtención de espermatozoides con cromosoma X). En cada grupo se evaluó via- bilidad espermática con tinción de eosina nigrosina y test hiposmótico (HOST) a tiempo cero (TO) y nuevamente terminado el proceso de sexado. Así también se calculó la concentración post sexado para el grupo en estudio y a través de la técnica de hibrida- ción in situ fluorescente (FISH) se determinó con microscopia confocal la proporción de espermatozoides con cromosoma X en cada muestra sexada Además como prueba biológica se inseminaron 4 yeguas con 250 millones de esperma- tozoides frescos sexados y utilizando la técnica intracornual profunda Los resultados del estudio determinaron que la viabilidad espermática no se ve afectada sino que además aumenta entre TO y post sexado con nano-partículas (p<0,0001) y la tasa promedio de espermatozoides X recuperados en los 30 eyaculados sexados fue de 91 5% según los resultados de FISH Además se preñaron las 4 yeguas inseminadas lo cual demuestra la fertilidad potencial del semen sexado y que al determinar el sexo fetal con ultrasonido a los 125 días de gestación fueron hembras en todos los casos (100%) Palabras claves: sexado cromosoma, espermatozoide, nano-partículas