Exopolifosfatasas, enzimas relacionadas con el estres y la supervivencia : Estudio molecular y computacional para entender la relacion entre estructura y funcion, y el modo de interaccion con ligandos
Resumen
En esta tesis Doctoral se estudia la enzima polifosfato fosfatasa de Escherichia coli cuya función es hidrolizar largas cadenas de polifosfato, de manera procesiva, a orto-fosfato. Esta proteína pertenece a la superfamilia de proteinas ASHKA, donde ha sido bien caracterizado el sitio activo. El estudio de esta proteína en particular es de importancia ya que conjuntamente con PPK (polifosfato quinasa) y mediante ensayos genéticos se ha demostrado que están relacionadas con la sobrevida bacteriana
En este trabajo se presentan diferentes enfoques computacionales para entender el modo de interacción del sustrato (polifosfato) con Ppx y con otros ligandos como ATP, GTP, ppGpp, pppGpp. Se realizan ensayos de Docking con estos ligandos y se evalúa la influencia del potencial electrostático en dichas interacciones. Este estudio a su vez, indaga las relaciones evolutivas con otras polifosfatasas, tal el caso de la proteína ortóloga de Pseudomonas aeruginosa, determinando la importancia, según el grado de conservación, de los residuos de unión al ligando,
Con el fin de conocer las implicancias en el modo de unión del sustrato a Ppx, se realizaron ensayos de dinámica molecular dirigida y se obtuvieron perfiles de energía libre que permitieron entender la importancia del largo de la cadena del polifosfato y la procesividad de la enzima. Mediante estas simulaciones se propuso al residuo H379 como fundamental para el reconocimiento del polifosfato de cadena larga, actuando como residuo portero o "gatekeeper"; que permite el pasaje por el acueducto (residuos E193, R165, E371, N377, H378 y R 9) formado en la interface de dimerización. La participación de este residuo crítico para la especificidad de sustrato de cadena larga fue corroborada por mutación sitio-dirigida y por ensayos cinéticos
De esta manera, se realizaron aportes para avanzar en el conocimiento de la relación entre estructura y función de esta enzima, lo que permite por extensión conocer también algunas características de su ortólogo en Pseudomonas aeruginosa como así también de polifosfatasas de otros organismos. Considerando la participación de los polifosfato en la sobrevida bacteriana, crecimiento, respuesta estricta, movilidad, "quorum sensing", etc, los avances realizados en este trabajo de tesis Doctoral, contribuyen a sentar las bases para el diseño racional de fármacos dirigidos a Ppx y así poder contrarrestar la acción patogénica de microorganismos dañinos para el hombre.
Colecciones
- Tesis de Doctorado [306]