Incorporacion sitio-especifica de transgenes para aplicaciones biotecnologicas : Produccion de una linea celular bovina con un locus artificial

Abstract

Originalmente el término transgénesis animal se acuñó para indicar la introducción de ADN exógeno o sustitución/remoción de secuencias endógenas en el genoma. Los avances en ingeniería genética y reprogramación de organismos vivos han posibilitado generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sin número de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Actualmente, se han desarrollado varias estrategias de transgénesis activa (modificaciones en el genoma catalizadas por enzimas), éstas incluyen meganucleasas, intercambio de casete mediada por recombinasa, transposones, nucleasas de diseño e integrasas. En base a estos antecedentes, se propuso desarrollar estrategias que permitan aumentar la frecuencia de integración de transgenes empleando un sistema de transgénesis activa En primera instancia, se generó mediante transposición (transposón Sleeping Beauty) una línea celular bovina portadora de un locus artificial de secuencia conocida (LAVenus), como herramienta para el estudio del fenómeno de recombinación homóloga, el knock-out de genes empleando el sistema CRISPR/Cas9 y el fenómeno de intercambio de casete mediante recombinación. Primeramente, se determinó que una relación equimolar entre los plásmidos donantes (pT2/RMCE/Venus y pT2/SVNeo) y el vector auxiliar que codifica la transposasa (pCMV-SB100X) genera la mejor eficiencia de integración del transgén en células bovinas. Posteriormente, se optimizó la transfección de las células portadoras del locus artificial empleando los vectores necesarios para el estudio del fenómeno de RMCE (pT2/RMCE/mCherry y pCAG-Cre); demostrando que es necesario utilizar una mayor relación molar del plásmido de intercambio con respecto al vector helper. También se demostró que el Sistema CRISPR/Cas genera elevados niveles de knock-out en el LAVenus; comprobando la alta eficiencia mutagénica de dicho sistema, incluso en relaciones molares en las cuales el plásmido codificante para el gARN (pgRNAVenus1/2) era significativamente menor al vector auxiliar (phCas9 Church). En conclusión, se puede afirmar que la escisión del ADN nuclear en el locus artificial Venus presente en el genoma bovino, favorece la integración de un gen heterólogo (mCherry) empleando el sistema RMCE Del mismo modo, se comprobó que el Sistema CRISPR/Cas es una herramienta molecular eficiente para generar el knock-out del transgén en el genoma bovino.