Produccion de una linea celular fibroblastica inmortal para aplicaciones transgenicas en la especie bovina.

Abstract

Las líneas celulares primarias poseen una vida finita bajo condiciones in vitro debido ala senescencia replicativa, lo que impide la introducción de modificaciones complejas. Unaalternativa a este impedimento es la introducción del gen de la telomerasa transcripta reversahumana (hTERT), la subunidad activa de la telomerasa, que posee actividad polimerasa RNA-DNA dependiente y adiciona así desoxirribonucleótidos en los extremos de los telómeros quese pierden por la incapacidad de la ADN polimerasa de sintetizar en dirección 3 ??5 ?. Elobjetivo de este trabajo fue la producción de una línea celular bovina inmortal mediante laexpresión forzada de la subunidad catalítica de la enzima TERT humana (hTERT). Seutilizaron cultivos de fibroblastos bovinos (L260 y 10.952), provenientes de biopsias de pielde bovinos adultos, crecidos en medio D-MEM con 10% de SFB y se transfectaron con 2plásmidos, propagados en E.Coli DH5a. Uno de ellos fue: pZGreen1N1, que posee un casetepara la expresión de la proteína verde fluorescente y otro para la neomicinafosfotransferasa(resistencia a Neomicina) y el otro pCIneo-hEST2, con casete para la expresión de hTERT yresistencia a neomicina. Previo a la incorporación de dichos plásmidos a las células bovinas,los mismos fueron identificados mediante restricción por endonucleasas. Se realizó mediante2 técnicas, una de ella física (electroporación), estudiando distintos voltajes para su puesta apunto, y la otra química, (JetPrime). En cada técnica se realizaron tres experimentos:transfección con pZGreenN1, transfección con pCIneo-hEST2 y co-transfección con ambosplásmidos. A las 72 hs luego de la transfección se contaron las células que mostraronexpresión de la proteína verde fluorescente y el total de células por campo, calculando elporcentaje de transfección transitoria del plásmido pZGreen1N1. Se obtuvieron líneascelulares de fibroblastos adultos bovinos luego de 21 días de selección con G418 y serecuperaron mediante el uso de anillos de clonado (?cloning rings?). Por ello fue posibledeterminar el porcentaje de transfección del plásmido pCIneo- hEST2. La transfección queotorgó mejor eficiencia fue aquella realizada sobre la línea celular 10.596 co-transfectada conambos plásmidos. Además se puso a punto la detección de la construcción pCI neo-hEST2mediante PCR. En conclusión, la expresión forzada de la subunidad catalítica de la enzimaTERT humana (hTERT) inmortaliza las líneas celulares bovinas.