Tecnologia de los anticuerpos aviarios y nanotecnologia aplicada a la sanidad bovina

Abstract

La diarrea neonatal bovina es una causa importante de morbilidad y mortalidad enterneros recién nacidos. Escherichia coli (E. coli) es considerada uno de los principalesagentes patógenos bacterianos causantes de este síndrome en terneros menores de10 días. Actualmente, para la prevención de diarreas infecciosas en ternerosdestetados y criados artificialmente en guacheras, se propone reemplazar el usorutinario de los antibióticos por la administración de sustancias alternativas, tales comolos anticuerpos aviarios (IgY) específicos, extraídos de la yema de huevo de gallinasinmunizadas contra los agentes etiológicos de la diarrea. Sin embargo, para poderutilizar la IgY como inmunoterapia pasiva, es imprescindible hallar un método efectivopara preservar su valor terapéutico y su función biológica durante el pasaje por elabomaso. Las investigaciones más recientes utilizan las aplicaciones farmacológicasde la nanotecnología para mejorar la eficiencia de la administración oral de la IgY. Elobjetivo de esta tesis fue evaluar la capacidad protectora de la IgY, administrada ennanoestructuras, para prevenir las diarreas neonatales causadas por E. coli enterneros. Se obtuvieron 620 hisopados rectales de terneros menores de 45 días deedad pertenecientes a 45 tambos de la Cuenca Lechera de Villa María, Provincia deCórdoba. Se aisló, identificó y tipificó, bioquímica y molecularmente, el patotipo de E coli prevalente. El análisis de los genes de virulencia intestinales de E. coli por PCRdemostró una alta prevalencia de cepas compatibles con E. coli enterotoxigénica(ECET). Este patotipo presentó una distribución espacial homogénea, cubriendo todael área geográfica muestreada. Se purificó la IgY obtenida de 8 gallinas inmunizadas y4 no inmunizadas mediante dos métodos diferentes: dilución en agua y polietilenglicol El método de dilución en agua y su posterior precipitación con sulfato de sodio, resultóser una técnica efectiva, práctica y económica para la purificación de la IgY. Laconcentración y el título de la IgY se determinaron mediante ELISA. El título de la IgYanti-ECET fue tres órdenes de magnitud mayor (1:100.000) que el de la IgY control(1:100). Se sintetizaron y caracterizaron hidrogeles de ácido acrílico/acrilamida, con elagregado de un 5% de nanotubos de carbono (NTC) funcionalizados con quitosano. Elmétodo de funcionalización de los NTC con quitosano resultó satisfactorio, dado quedisminuyó el grado de aglomeración de los mismos. La unión covalente entre elquitosano y los NTC fue evidenciada por espectroscopía FTIR. Los hidrogeles con unaproporción equimolar (1:1) de sus monómeros presentaron un mayor porcentaje dehinchamiento y contenido de agua a pH básicos y se mantuvieron colapsados a pHácidos, siendo los elegidos para los ensayos posteriores. La IgY fue incorporada enhidrogeles pH-sensibles y se evaluó su estabilidad in vitro en condiciones gástricas eintestinales simuladas. La utilización de los compuestos hidrogel-NTC mejoró laeficiencia de incorporación de la IgY, permitió una liberación controlada y mantuvo unaactividad biológica del 85% luego del pasaje por el fluido gástrico. La interacciónhidrogel-NTC-IgY fue evidenciada por espectroscopia FTIR. Se desarrolló un modelode infección experimental en 20 terneros neonatos para evaluar el efecto protector dela IgY encapsulada, frente al desafío con ECET. Se demostró que la administraciónoral de la IgY anti-ECET incorporada en compuestos hidrogel-NTC redujo el númerode animales enfermos, la duración y la severidad de la diarrea. Los animales tratadoscon esta IgY tuvieron una ganancia de peso mayor que la de los animales que nofueron tratados. Mediante técnicas histológicas convencionales se comprobó que laadministración oral de los compuestos hidrogel-NTC-IgY no indujo procesosinflamatorios en la mucosa del duodeno o yeyuno-íleon de ninguno de los animalesque fueron desafiados. En esta tesis se han aportado resultados inéditos sobre lafuncionalidad de la IgY administrada en hidrogeles pH-sensibles para prevenir lasdiarreas neonatales causadas por E. coli en terneros de tambo.