Respuestas de pseudomonas frente al estres ocasionado por detergentes cationicos y su relacion con la capacidad de biodegradar estos compuestos

Abstract

En este trabajo de tesis se analizaron los mecanismos adaptativos que le permiten aPseudomonas putida A ATCC 12633 contrarrestar el daño ocasionado por agentes queperturban la integridad de su membrana. Particularmente se estudiaron los cambios a nivelde fosfolípidos y las actividades enzimáticas involucradas en la respuesta de P. putida AATCC 12633 frente al estrés ocasionado por la presencia del detergente catiónico sintéticoBr-tetradeciltrimetilamonio (TDTMA) y la del metal tóxico aluminio (A1+3) En células de P. putida A ATCC 12633 expuestas a TDTMA durante cortos periodosde tiempo, el contenido de cardiolipina disminuyó un 60 %, mientras que los niveles defosfatidilglicerol y ácido fosfatídico incrementaron con valores superiores al100 %, respecto a lo detectado en células no expuestas al detergente. En células crecidascon TDTMA como única fuente de carbono y nitrógeno, los cambios más significativosfueron también aumento de ácido fosfatídico y fosfatidilglicerol, pero el contenido decardiolipina no se modificó. Estos resultados permitieron implicar a los fosfolípidos aniónicosen la respuesta bacteriana a TDTMA, utilizando principalmente ácido fosfatídico paraneutralizar la alta densidad de carga positiva presente en la molécula del surfactante. Laactividad fosfolipasa D (PLD) detectada en células de P. putida A ATCC 12633 crecidas confuentes preferenciales de carbono y nitrógeno, sumada al incremento de esta actividadenzimática que se detectó cuando las células se enfrentaron a TDTMA, permitieronproponer que esta enzima es la responsable de catalizar la hidrólisis de cardiolipinagenerando, de manera rápida y eficaz, parte de los aumentos de fosfatidilglicerol y ácidofosfatídico necesarios para contrarrestar el daño inicial ocasionado por el detergente La obtención y caracterización de una cepa mutante de P. putida A ATCC 12633afectada en el gen homólogo a cardiolipina sintasa (cls) (P putida GP01) mostró unadistribución y un contenido de cardiolipina semejante a lo detectado en su cepa parental,indicando que en P. putida A ATCC 12633 existe un gen adicional responsable de codificaruna c/s o bien que, en esta cepa, cardiolipina es sintetizada a través de otra enzima queguarda cierta homología con CLs, como es el caso de la fosfatidilsenna sintasa clase I Adicionalmente, la caracterización de la cepa mutante P. putida GP01 mostró ausencia deactividad PLD, lo que llevó a concluir que la mutación generada en el gen homólogo a c/safectó una actividad PLD, si bien no es posible descartar, hasta el momento, que dicho gencodifique para una actividad dual PLD / CLsEl análisis por microscopía electrónica de transmisión de la integridad de lamembrana celular de P. putida A ATCC 12633 crecida con TDTMA como única fuente decarbono, nitrógeno y energía, mostró que la presencia del detergente no producealteraciones en la integridad de la misma, si bien se detectan la presencia de estructurasintracelulares (pseudovacuolas) y la liberación de vesículas de membrana al medio. Por otrolado, el análisis del contenido de fosfolípidos en esta condición nutricional mostró, en estacepa, un notorio incremento en el contenido de fosfolípidós totales, lo cual refleja distintasestrategias llevadas a cabo por el microorganismo para sobrevivir en presencia delsurfactante. Posiblemente el incremento de fosfolípidos totales lleve a una menor adsorciónde TDTMA a la membrana celular y la liberación de vesículas a la excreción de compuestosno deseados de su metabolismo Durante el crecimiento de P. putida A ATCC 12633 con TDTMA como única fuentede carbono, nitrógeno y energía, la adición de Ar al ?viedio, necesario para lograr lacompleta mineralización de TDTMA, provocó, entre otros cambios, un incremento en elcontenido de fosfatidilcolina. Extractos libres de células provenientes de P. putida A ATCC12633 crecida en presencia de fuentes preferenciales de carbono y nitrógeno o con TDTMApermitieron identificar que en esta cepa, la síntesis de fipsfatidilcolina se lleva a cabo através de la vía de la fosfatidilcolina sintasa (PCS) y que esta actividad enzimática esindependiente de la adición de colina exógena y activada por la presencia de Ar. Seidentificó, mediante la expresión y la obtención de una cepa mutante, que el gen deP. putida A ATCC 12633 homólogo al orf pp0731 de P. putida KT2440 y al gen pcs deSinortuzobium melitoti, es el responsable de codificar para fosfatidilcolina sintasa en estacepa Por otro lado se demostró, mediante ensayos de viabilidad celular y fluorescencia,que la cepa de P. putida A ATCC 12633 mutante en pcs y carente de fosfatidilcolina en sumembrana, es mucho más sensible que su cepa parental cuando se expone a Ar ycontiene menor cantidad del catión unido a sus membranas, comportamiento revertido porensayos de complementación con el gen pcs. En conjunto, estos resultados corroboran lahipótesis de que fosfatidilcolina participa en la respuesta bacteriana al Ar actuando comoen reservorio temporario del ión. El mecanismo propuesto implica la formación, en lamembrana de P. putida A ATCC 12633, de complejos Al3+-fosfatidilcolina los cuales, por unlado, disminuyen el contenido de Al3+ libre que puede ser tóxico para el microorganismo y,por otro, mantienen disponible Al3+ para cuando P. putida A ATCC 12366 necesite utilizarlopara disminuir los niveles inhibitorios de trimetilamina intracelular que se producen comoconsecuencia del metabolismo de TDTMA y lograr así la completa mineralización deldetergente.