Estudio de la interaccion entre tubulina y PMCA y su influencia sobre la regulacion de su actividad enzimatica

Abstract

PMCA expulsa el calcio desde el interior celular, esta proteína es una de lasprincipales enzimas involucradas en la mantención de las concentraciones de este ion enla célula. El calcio es un segundo mensajero temprano que desempeña un papel clave enprocesos fisiológicos incluyendo la proliferación, diferenciación y apoptosis. Nuestrosestudios muestran que PMCA se asocia parcialmente a tubulina acetilada, modificandosu actividad enzimática. Varios puntos refuerzan la idea de que tubulina acetilada yPMCA forman un complejo (a) PMCA y tubulina acetilada están presentes en lasmembranas que aislamos (b) Cuando los PMVs son solubilizados en detergente yparticionados en Tritón X-114, tanto PMCA como tubulina acetilada se encuentran en lafase detergente, mientras que tubulina acetilada es un componente hidrofilico queparticionaría en la fase acuosa (c) Cuando las membranas se solubilizaron con Tritón X-100 y subsecuentemente se inmunoprecipitó con 6-11B-1 o 5F10 unido a las perlas desefarosa, PMCA precipita junto con tubulina acetilada (d) Cuando las membranas sondepletadas de tubulina acetilada (por tratamiento con etanol) y solubilizadas condetergente e inmunoprecipitadas con anti-tubulina acetilada unido a perlas de sefarosa,PMCA no precipita, sin embargo cuando las membranas han sido previamenteincubadas con tubulina acetilada purificada exógena, PMCA precipita (e) Cuandopreparaciones que contenían PMCA purificada y tubulina purificada fueronparticionadas con Tritón X-114, ambas proteínas fueron encontradas en la fasedetergente La formación del complejo tubulina acetilada/PMCA modifica a la actividad dela enzima. Cuando el complejo tubulina acetilada/PMCA es disociado, tubulina no seencuentra en la fase detergente, sino en la fase acuosa de la partición con Tritón X-114 La disociación del complejo (disminución de tubulina acetilada en la fase detergente)por etanol ó calmodulina resulta en una estimulación de PMCA lo que indica que lainteracción de tubulina con PMCA inhibe la actividad de PMCA en PMVs y que elcomportamiento hidrofóbico de tubulina se debe a su asociación con un componentehidrofóbico (PMCA o un complejo que contiene a PMCA). La disociación del complejotubulina/PMCA es confirmada por experimentos de inmunoprecipitación. Nuestrosresultados demuestran que tubulina acetilada puede interaccionar con PMCA y de estamanera regular la actividad de PMCA Woelia E. MonesteroCo 6111PFLVE,9VCI4 DE_ 71.437..)LEArA A(1E77LA` t SOBWE LA ACTP9IIDA.1.) LYLI5141:ASe ha demostrado previamente que el isotipo acetilado de tubulina esindispensable para la interacción con la bomba sodio (Santander y col., 2006). Aquí,hemos demostrado que el mismo isotipo de tubulina es necesario para la interacción conla bomba calcio y que la isoforma PMCA4 participa en la formación de complejo. Esposible que tubulina acetilada interaccione y regule la actividad de todas las P-ATPasas Nuestros resultados muestran que la estabilidad de los microtúbulos afecta a laactividad de PMCA, ya que ante el agregado de taxol la actividad de PMCA se veincrementada, y la formación de complejo tubulina acetilada/PMCA disminuido. Lomencionado anteriormente refuerza la idea postulada que ante la disociación delcomplejo tubulina acetilada/PMCA la actividad se ve estimulada y cuando hay mayorformación del complejo la actividad de PMCA se ve disminuida, esto también fueobservado in vivo con la utilización de células en cultivo. En efecto en células COS,CAD y eritrocitos la concentración de calcio intracelular disminuyo por acción dePMCA ante el agregado de etanol acompañado por una disminución en la formación delcomplejo tubulina acetilada/PMCA Otros experimentos demuestran que los lípidos que rodean al complejo influyensobre el efecto que causa la tubulina acetilada sobre la actividad de PMCA. Cuando laenzima purificada a partir de PMVs es reconstituida en lípidos ácidos la formación delcomplejo tubulina/PMCA estimula la actividad enzimática, mientras que si lareconstitución de PMCA se realiza en lípidos neutros el efecto que provoca la tubulinaes dependiente de la concentración de tubulina, así a bajas concentraciones de tubulinapurificada observamos una estimulación de la actividad, mientras que a altasconcentraciones de tubulina en estas preparaciones no se observan cambios en laactividad enzimática. En otros experimentos observamos que cuando los PMVs sontratados con tubulina purificada exógena la actividad de PMCA resulta inhibida, pero sien los PMVs aumenta la cantidad de DAG por acción de PLC, la inhibición producidapor tubulina acetilada exógena es revertida En conjunto estos estudios nos permiten concluir que PMCA y tubulina acetiladaforman un complejo y que la actividad de PMCA es regulada por tubulina acetilada,esta regulación es dependiente de la concentración de tubulina y la composición lipídicaque rodea al complejo.