Lipido quinasas de Trypanosoma cruzi: respuesta a la estimulacion celular y mecanismos involucrados en las señales de transduccion

Abstract

Gran parte del conocimiento que se tiene acerca de la señal de fosfolípidos ha sidoadquirida del estudio de sistemas animales. Sin embargo el mecanismo por el cual eucariotasinferiores y en especial Trypanosoma cruzi transducen las señales al interior de las células esmuy poco conocido. Por ello, en este Trabajo de Tesis se analizó la cinética del comportamientode fosfolípidos, algunas enzimas involucradas en su metabolismo, la participación de losmismos en la respuesta del parásito frente a estímulos extracelula res y su relación con la serial decalcio A través de fosforilación de las membranas del parásito se determinó la presencia de dosfosfolípidos diferentes a los ya conocidos, el ácido lisofosfatídico (LPA) y el diacilglicerolpirofosfato (DGPP), productos de monoacilglicerol quinasa (MAG-k) y fosfatidato quinasa(PA-k) respectivamente. Esta última es de especial importancia para T. cruzi ya que losmamíferos no la poseen, y su producto DGPP, es capaz de activar elementos de la respuestainflamatoria en macrófagos, sugiriendo funciones importantes en la invasión de lostripanosomas a su hospedador humano. En epimastigotes, la síntesis de DGPP estáestrictamente acoplada al incremento de PA, por lo que PA-k y DGPP-fosfatasa tendrían algunaimplicancia en los procesos de transducción de señales. Mediante el empleo de activadores einhibidores de fosfatasas y técnicas de inmunoblot, se confirmó la presencia de esta DGPP-fosfatasa en las formas epimastigotes. La enzima se ubicó preferentemente en las membranasinternas del parásito, probablemente en los acidocalcisomas. Dado que éstas son organelas queactúan como reservorio de energía, se sugiere que entre las posibles funciones del DGPP, unasería la de actuar como metabolito energético Por otro lado, se analizó el compromiso de polifosfoinosítidos y PA en la respuesta delparásito frente a mastoparan, un activador de proteínas G. El tratamiento de las células con estepéptido a concentraciones no permeabilizantes indujo activación de la fosfolipasa C (PLC). Estaactivación fue dependiente del aumento en la concentración de calcio intracelular ([Ca211),provocada por influjo del catión desde el medio. Consecuentemente con la activación de PLC, seincrementó la actividad DAG-k y el recambio de su producto, el PA. Este fosfolípido sería elresponsable del aumento en la actividad de la PIP-k observado luego de la estimulación delparásito con mastoparan, ya que como fue demostrado por nuestro grupo de trabajo el aumentoen los niveles de PA activan a la PIP-k. De esta manera, PA retroalimentaría al ciclo del inositolfosfato positivamente Se demostró también en epimastigotes la presencia de fosfolipasa D (PLD) y su activaciónen respuesta a estímulos externos tales como el activador de proteína G mencionadoanteriormente. La enzima demostró ser homóloga a la PLD2 de humanos aunque de ubicacióncitoplasmática. En el parásito luego de la estimulación celular, la enzima se transloca a lamembrana flagelar para su activación. Dicha translocación sería consecuencia del aumento enlos niveles de PIP2, fosfolípido que en otros sistemas actúa como cofactor de la enzima. En apoyoa esta interpretación se puede mencionar el hecho que aquellos estímulos que no produjeronaumentos en los niveles del fosfoinosítido, tampoco aumentaron la actividad PLD La estimulación de los parásitos con el péptido 1-40, un derivado sintético de la ap-globinade pollo que promueve la diferenciación de epimastigotes de T. cruzi, también activó a PLC, a laslípido quinasas relacionadas y a la señal de calcio. En este caso los resultados fueronindependientes de la presencia de calcio en el medio de incubación, a diferencia de lo descritopara mastoparan, donde la activación de PLC se produjo por aumentos en la [Ca2 ]i. Ello sedebería a que en presencia del péptido 1-40 la PLC se activa por interacción entre su regiónaltamente cargada que posee y las subunidades By de la proteína G El estrés hiperosmótico, a una osmolaridad equivalente a la que los epimastigotesnormalmente encuentran en el recto de la vinchuca, lugar donde se lleva a cabo lametaciclogénesis, produjo efectos similares a los descritos para el mastoparan, es decir, aumentode la actividad PLC dependiente del incremento de la [Ca2li, y estímulo de DAG-k, PPI-k yPLD. En el caso de la hiperosmolaridad el aumento en la [Ca2+1i fue sensible a EIPA, uninhibidor del intercambiador Na+/1-1+, hecho que indica que este incremento sería consecuenciade la liberación del ion desde los acidocalcisomas, luego de la activación conjunta de losintercambiadores Na+/H+ y HilCa2+ presentes en las membranas de dichas organelas. Bajo lasmismas condiciones que estimularon a las enzimas involucradas en la generación de señales, seobservaron cambios en los parámetros de crecimiento y en la morfología de los parásitos:aumento en el volumen de los acidocalcisomas y elongación flagelar, este último un requisitoindispensable para disparar el proceso de metaciclogénesis Los resultados obtenidos permiten sugerir que en epimastigotes de T. cruzi existe unaactivación coordinada y secuencial de las vías de transducción de señales mediadas por lípidos Esta activación tendría una función importante, no sólo como uno de los elementos de respuestacelular, sino también como uno de los eventos tempranos en la progresión de lametaciclogénesis, promoviendo la diferenciación del parásito a una forma que le permitirácolonizar las células del hospedador mamífero.