Productividad numerica de la cerda : componentes y factores que la afectan

Abstract

Las bacteriocinas son compuestos antimicrobianos de naturaleza proteica, producidos por bacterias, capaces de matar a bacterias relacionadas filogenéticamente a la cepa productora. Desde el punto de vista biotecnológico, las bacteriocinas tienen un gran potencial para ser aplicadas en la industria alimenticia, la medicina y el área agronómica. El objetivo del presente trabajo es estudiar la producción, regulación y el mecanismo de acción de las bacteriocinas producidas por la rizobacteria promotora del crecimiento vegetal Pseudomonas fluorescens SF4c. Mediante un análisis in silico, se identificaron genes para cuatro bacteriocinas en el draft del genoma de la cepa SF4c. En el contig 5 y 12, se identificaron genes (que denominamos pyoS) que codifican para bacteriocinas homólogas a las piocinas tipo S (compuestos solubles de bajo peso molecular). Además, un cluster de aproximadamente 48 genes, que codifica para tailocinas tipo R y F (bacteriocinas de alto peso molecular similares a colas de fagos), fue identificado en el contig 18. La cepa SF4c fue capaz de inhibir a una gran variedad de cepas de los géneros Pseudomonas y Xanthomonas, incluyendo a bacterias fitopatógenas. Las bacteriocinas presentaron propiedades características de piocinas tipo S (como sensibilidad a la temperatura y formación de grandes halos de inhibición en placas de cultivos) y de las tailocinas (tolerancia a temperaturas elevadas y producción de halos de inhibición de pequeño diámetro). Un análisis proteómico comparativo entre bacteriocinas extraídas de cultivos tratados con mitomicina C y sin tratar reveló que P. fluorescens SF4c produce ambos tipos de bacteriocinas (tipo S y tailocinas). Las bacteriocinas tipo S se detectaron a través de péptidos de confianza media, probablemente debido a una baja proporción de esas proteínas en las XIV muestras. Mientras que, las proteínas estructurales de tailocinas R y F se detectaron, mediante péptidos de alta confianza, en al menos una de las dos muestras analizadas (inducidas con mitomicina C o sin inducir). Cuando las células se trataron con mitomicina C, se observó una mayor abundancia de proteínas asociadas a las tailocinas. Además, la estructura similar a cola de bacteriófagos de las tailocinas fue confirmada mediante AFM. Los genes orf1, orf2 y hol se cotranscriben en un mensajero policistrónico en P. fluorescens SF4c, por lo que el primer gen del cluster de tailocinas es orf1. Previamente, corriente arriba de orf1 fueron predichos dos posibles promotores de tailocinas (P tail I y P tail II); en este trabajo se midió la actividad de los promotores y se observó que ambos son necesarios para una expresión máxima de tailocinas, pero P tail I es el promotor activo primario. Además, la actividad de estos promotores se incrementó cuando los cultivos fueron inducidos con mitomicina C, lo cual confirma resultados previos que indican que la respuesta SOS está involucrada en la expresión de tailocinas en P. fluorescens SF4c. Además, se analizó otra señal ambiental que podrían afectar la producción de bacteriocinas, como la limitación de nitrógeno. En este caso, la limitación nutricional probada no afectó la producción de bacteriocinas. Como en otras Pseudomonas asociadas a plantas, en la cepa SF4c se pudo identificar el gen prtR; pero no fue detectado ningún gen homólogo a prtN. PrtR de la cepa SF4c presentó elevada similitud con su ortólogo en P. aeruginosa PAO1 en términos de dominios conservados y secuencias características de represores que participan en la respuesta SOS. La función de prtR en la regulación de la síntesis de bacteriocinas no ha sido estudiada más allá de la especie P. aeruginosa. En este trabajo, se construyó un mutante nulo de prtR derivado de la cepa SF4c con la finalidad de estudiar la función de prtR en esta cepa. La producción de tailocinas se abolió completamente en este mutante. Además, no se detectó actividad del promotor en el mutante prtR-, mientras que la cepa de tipo salvaje mostró una actividad promotora significativamente fuerte. Estos resultados sugieren que, a diferencia de P. aerugionosa, PrtR regula la expresión de tailocinas en P. fluorescens SF4c de manera positiva. Las tailocinas de la cepa SF4c, además de mostrar actividad antagonista contra un conjunto selecto de Pseudomonas, tienen actividad inhibitoria contra la cepa fitopatógena X. vesicatoria Xcv Bv5?4a, agente causal de la mancha bacteriana en plantas de tomate y pimiento. Por lo tanto, las tailocinas podrían usarse en el futuro como un agente de control biológico de la mancha bacteriana de la hoja. Sin embargo, fue necesario saber cómo actúan XV estas tailocinas sobre las bacterias fitopatógenas para ser consideradas como un posible agente de control microbiano. En este trabajo, se utilizó AFM como una herramienta para estudiar el efecto producido por las tailocinas de la cepa SF4c sobre X. vesicatoria Xcv Bv5?4a. Las imágenes de AFM muestran que las tailocinas SF4c se adhieren a la envoltura celular de la cepa sensible Xcv Bv5-4a, causando cambios en su estructura y una pérdida progresiva del volumen celular. Esto se visualiza y cuantifica como una disminución en la altura de las células, probablemente debido a la formación de poros. De este modo, los poros causarían una rápida fuga de materiales intracelulares y, finalmente, la lisis de las bacterias sensibles. Para comprobar esto, se midió el eflujo de potasio desde las células sensibles a las tailocinas. La concentración extracelular de K+ fue mayor cuando la cepa Xcv Bv5-4a se trató con las tailocinas, lo que sugiere un aumento en la permeabilidad de la membrana por la formación de poros. Además, la pérdida de turbidez de los cultivos de la cepa Xcv Bv5-4a tratados con las tailocinas demuestra que ocurre lisis celular y posterior muerte de la bacteria fitopatógena. Finalmente, se aplicó la espectroscopia FTIR para explorar los cambios bioquímicos globales a nivel de la población y s-SNOM para estudiar la naturaleza bioquímica de una sola bacteria a nivel de la nanoescala. Se caracterizaron espectroscópicamente células de X. vesicatoria Xcv Bv5-4a tratadas o no con las tailocinas de la cepa SF4c. Los espectros obtenidos de células control de Xcv Bv5-4a se agruparon por separado de los obtenidos cuando las células se trataron con las tailocinas, principalmente en la región de la huella dactilar y en la región relacionada con los lípidos, donde los modos vibratorios relacionados con fosfolípidos de membrana se ven modificados. Esto revela el daño producido en las envolturas celulares cuando células de Xcv Bv5-4a son tratadas con las tailocinas. Este trabajo describe la caracterización de nuevas bacteriocinas y demuestra por primera vez, según nuestro conocimiento, la función de PrtR en la regulación de la expresión de tailocinas en una cepa de Pseudomonas asociada a plantas y el efecto de las tailocinas de la cepa SF4c sobre una cepa sensible mediante AFM, espectroscopia FTIR y s-SNOM.