Adherencia de azospirillum brasilense a raices a Zea Mays y su colonizacion bajo condiciones de estres salino

Abstract

En el presente trabajo se estudió la adherencia de Azospirillum brasilense a maíz y su colonización bajo condiciones de estrés salino generado mediante el agregado de 300 mM de NaCI. Se observó una disminución significativa en el número de bacterias que se adhieren a raíces de maíz tanto en la fase de adsorción, como en la de anclaje. La colonización de raíces de plántulas de maíz también se encontró alterada en estas condiciones. Cuando se analizaron componentes superficiales de la bacteria posiblemente implicados en la adherencia y colonización, se encontró que el estrés salino produce alteraciones en la producción de exopolisacáridos (EPS), en el perfil electroforético de lipopolisacáridos (LPS) y de proteínas de membrana externa. También se encontraron cambios significativos en componentes del periplasma de Azospirillum brasilense reflejados en modificaciones tanto en el perfil electroforético de las proteínas, como en el cromatográfico de glucanos con marcada disminución en la producción de estos últimos. La transcripción de genes promotores de la fijación de nitrógeno tales como nifA y nifH, se encontró alterada en estrés salino, como así también la inducción de éstos por exudados radicales de maíz, sugiriendo que las alteraciones producidas por la salinidad afectan la respuesta de la bacteria a los exudados radicales. La transcripción de nifH en condiciones de salinidad está disminuida significativamente, lo que afectaría en forma negativa la capacidad de fijar nitrógeno. Con el propósito de analizar con más detalle la participación de polisacáridos superficiales en la adhesión y colonización radical, como así también en la tolerancia a salinidad, se generaron y caracterizaron mutantes por inserción Tn5 con alteraciones en el péptidoglucano, la producción de EPS y la síntesis del LPS. Dichas mutantes fueron empleadas en estudios de tolerancia a salinidad, adherencia y colonización de raíces de maíz. Una de las mutantes alteradas en la síntesis del péptidoglucano e hiperproductora de EPS, mostró un retardo significativo en el crecimiento en medios salinos comparado con la cepa salvaje. Además se observó una capacidad muy disminuida para colonizar raíces de maíz tanto en condiciones normales como de estrés salino. Los resultados sugieren que el péptidoglucano como así también los EPS podrían estar involucrados tanto en la tolerancia a estrés salino como en la colonización radicular. El fragmento EcoRI interrumpido por el Tn5 fue clonado, subclonado y parcialmente secuenciado. Los datos de secuencia indican que la producción alterada de EPS podría estar asociada a una alteración primaria en la síntesis del péptidoglucano causada por mutación en la D- alanina-D-alanina ligasa. La mutante Tn5 con alteraciones en el perfil electroforético de los LPS tiene una capacidad muy disminuida de colonizar las raíces de maíz en condiciones normales, pero muestra mayor colonización que la cepa salvaje bajo condiciones de estrés salino. La adherencia de esta mutante no se encuentra alterada. El fragmento EcoRt interrumpido por el Tn5 fue clonado, subclonado y secuenciado. La secuencia parcial mostró significativa similitud con glucosa-1-fosfato timidil transferasa de Salmonella enterica, E. coli, Shigella tlexneri, Salmonella typhimurium y Sinorhizobium meliloti. Esta enzima participa en la biosíntesis del LPS y en S. meliloti está implicada en la biosíntesis del EPSII. Por otra parte, se obtuvo una mutante Tn5-/acZ que presenta una disminución en la tolerancia a estrés salino, la cual permitirá estudiar los mecanismos de osmotolerancia. Los resultados en su conjunto indican que los procesos de adherencia y colonización de Azospirillum brasilense se encuentran alterados bajo condiciones de salinidad. Posiblemente estas alteraciones estén asociadas a los cambios observados en los componentes de la superficie bacteriana producidos por el estrés salino. Esta es la primera evidencia que refleja una posible participación de los LPS de A. brasilense en la colonización de raíces de maíz, como así también el primer estudio donde se obtienen y caracterizan mutantes de A. brasilense alteradas en la síntesis del péptidoglucano